如何選擇**抗體以及二抗應(yīng)用實(shí)例分析

抗體：是高等動(dòng)物在抗原物質(zhì)的刺激下由漿細(xì)胞產(chǎn)生的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的**球蛋白。抗體通常存在于血清和**（組織液）中。

單克隆及多克隆抗體：由單一克隆的細(xì)胞（通常是單一克隆的雜交瘤細(xì)胞）所產(chǎn)生的識(shí)別某一抗原表位的單一抗體；多克隆抗體是由多種細(xì)胞分別接觸相應(yīng)抗原而產(chǎn)生的多種抗體的總和，多克隆抗體識(shí)別抗原的多個(gè)表位。

抗體結(jié)構(gòu)：抗體是由四條肽鏈構(gòu)成的“Y”形對(duì)稱的分子，包括兩條重鏈和兩條輕鏈。在“Y”的**部位的氨基酸順序在不同的抗體分子中差別很大，是負(fù)責(zé)與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的區(qū)域，稱為可變區(qū)，余下的區(qū)域則稱為恒定區(qū)。

抗體分類：根據(jù)重鏈恒定區(qū)的血清學(xué)類型，可將抗體分為IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五類，它們的重鏈分別為mu, gamma, alpha, delta, epsilon鏈。在上述每一類別中，按重鏈構(gòu)造上的變異又可分為幾個(gè)亞類，例如人的IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四個(gè)亞類。小鼠的IgG有IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3四個(gè)亞類。詳細(xì)討論見(jiàn) 小鼠抗體

輕鏈分為兩種類型，kappa鏈和lambda鏈，但每種抗體中只存在一種類型的輕鏈。

二抗：二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在**學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛，如western blot（通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），**組織化學(xué)（檢測(cè)組織中的特異性抗原），**細(xì)胞化學(xué)（通過(guò)**學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成），流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類型的細(xì)胞）及**沉淀（通過(guò)抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原）。二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。

二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。

如何選擇**抗體以及二抗應(yīng)用實(shí)例分析

通常情況下，某一特定的實(shí)驗(yàn)中可能同時(shí)有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實(shí)驗(yàn)的二抗，需要綜合以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：

一抗是在什么物種來(lái)源的，相應(yīng)的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內(nèi)制備的，那么你就應(yīng)當(dāng)選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內(nèi)制備的，那么二抗就應(yīng)當(dāng)是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動(dòng)物中制備的對(duì)二抗的質(zhì)量并無(wú)明顯的影響。

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類**球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。

單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對(duì)這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。

如果你不知道一抗是哪一類別或亞類，那么抗小鼠IgG是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類型的IgG**球蛋白。

UC Davis Dr. Trimmer 著文表明常用的抗IgG的**抗體對(duì)IgG1亞型的測(cè)定并不靈敏。而IgG1亞型是常用的一抗亞型。 因此作者建議實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)用抗IgG亞型的二抗 [1] 。

下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：

• 針對(duì)整個(gè)抗體分子（H＋L）具有特異性：如抗IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(xiàn)(ab’)2/Fab部分均可反應(yīng)，抗IgG(H+L)也可以與其他**球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因?yàn)樗械?*球蛋白都具有相同的輕鏈（kappa鏈或lambda鏈）。
• 針對(duì)Fab片段具有特異性：這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也已和具有相同輕鏈的其他種類的**球蛋白反應(yīng)。
• 對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性：這類抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，它們是類別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM，依此類推）。
• 輕鏈（kappa，labmda）特異性：與所有類別的抗體反應(yīng)，因?yàn)樗蓄悇e的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。
• 經(jīng)過(guò)吸附處理的二抗：不同來(lái)源的**球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，有些二抗經(jīng)過(guò)了動(dòng)物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過(guò)的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。

• 整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
• F(ab’)2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
• Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來(lái)封閉內(nèi)源性**球蛋白。

一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞**化學(xué)，組織**化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，**組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。

下面簡(jiǎn)單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的實(shí)驗(yàn)：

• 酶：主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟(jì)、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于**組化，western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的**檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如ELISA和western blot.
• 熒光基團(tuán)：
  • FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團(tuán)，但其大的缺點(diǎn)是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。
  • AMCA：常用在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，如**熒光、流式細(xì)胞術(shù)。其缺點(diǎn)是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測(cè)其所激發(fā)的藍(lán)色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。
  • 花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強(qiáng)。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。但Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。
  • TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，也可以使用RRX或TR，但TR會(huì)產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。
  • PE：常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
  • 生物素：生物素（biotin）可以和***蛋白（avidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團(tuán)的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個(gè)位點(diǎn)上，從而極大的放大檢測(cè)信號(hào)。
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親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度高，產(chǎn)生的非特異性背景少。但是有些情況下也要考慮到純化過(guò)程中損失的IgG部分，因?yàn)槠渲泻杏H和力很高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時(shí)候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

為分析二抗的使用情況，我們隨機(jī)抽取了100篇2007年或2008年發(fā)表于Science 或 Journal of Biological Chemistry雜志上的 文章(英文)，這些文章涵蓋了來(lái)自于16個(gè)國(guó)家的約80個(gè)研究機(jī)構(gòu)。收集的數(shù)據(jù)顯示二抗的使用非常廣泛，可以應(yīng)用到幾乎所有類型的**檢測(cè)中，尤其是Western blot、**組織化學(xué)和**細(xì)胞化學(xué)。事實(shí)上，二抗在ELISA及流式細(xì)胞術(shù)中應(yīng)用也很廣泛，不僅用于科學(xué)研究，而且廣泛的應(yīng)用于臨床分析和**診斷。比較而言，二抗在**沉淀中的應(yīng)用相對(duì)較少。以下內(nèi)容是基于對(duì)所收集的二抗信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出的一些結(jié)論，對(duì)于您在具體的實(shí)驗(yàn)中如何選擇適合的抗體具有借鑒作用。

選擇二抗時(shí)，您必須考慮到以下因素，如一抗的物種、產(chǎn)生二抗的宿主、一抗的類別或亞類、二抗所耦聯(lián)的探針類型及二抗的形式（如整個(gè)IgG分子，F(xiàn) (ab’) 2片段，或Fab片段）等等。因此選擇哪種類型的二抗很大程度上決定于您所使用的一抗是什么，尤其針對(duì)種屬和類別而言。

通常情況下，一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及綿羊體內(nèi)制備，其中屬小鼠及兔子為常見(jiàn)，相應(yīng)的，二抗的種屬也應(yīng)當(dāng)與一抗的相一致。而對(duì)于制備二抗的宿主，則應(yīng)選擇另外一種不同的動(dòng)物，一般選用驢、山羊、兔子、綿羊或其他較大的動(dòng)物，可以實(shí)現(xiàn)二抗的大規(guī)模制備，其中又屬山羊使用多。

對(duì)于二抗類別或亞類的選擇，應(yīng)遵循與一抗類別或亞類相一致的原則，其中抗IgG使用多。這可能是因?yàn)槌宋宸N類別的單克隆抗體外，很多一抗是多克隆抗體，屬于IgG類**球蛋白。此外anti-IgG可以識(shí)別幾乎所有類型的IgG亞類，因此，在不清楚一抗是屬于那個(gè)類別或亞類的時(shí)候，anti-IgG抗體是個(gè)不錯(cuò)的選擇。從我們的數(shù)據(jù)來(lái)看，值得注意的是， IgG亞類特異性的二抗（如抗IgG1, 抗IgG2, 抗IgG2a, 抗IgG2b）通常用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，包括**細(xì)胞化學(xué)、**組織化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)。

此外，整個(gè)IgG分子是常用的一種二抗分子形式，而F (ab’) 2片段或Fab片段一般僅用于特殊實(shí)驗(yàn)中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況，或需要封閉內(nèi)源性**球蛋白的時(shí)候。

對(duì)于二抗所耦聯(lián)的探針的選擇，主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Western blot，常用的探針是辣根過(guò)氧化酶（HRP），堿性磷酸酶（AP）的使用也很多，但不如HRP使用廣泛。此外，IRDye (如 IRDye 680、IRDye 800) and Alexa Fluor dye (如Alexa 680 ) 等系列染料也偶爾應(yīng)用于 western blot當(dāng)中。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于Amersham Biosciences、Bio-Rad、Cell Signaling、GE Healthcare Bio-Science、Jackson ImmunoResearch Laboratories、LI-COR Biotechnology、Pierce Biotechnology、Santa Cruz Biotechnology、Sigma 及 Zymed Laboratories公司的HRP標(biāo)記的二抗在Western blot中均有廣泛使用；而對(duì)于AP標(biāo)記的二抗，您可以選擇Jackson ImmunoResearch Laboratories、Sigma、Bio-Rad 及DAKO公司。

對(duì)于**熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（包括**細(xì)胞化學(xué)及**組織化學(xué)），應(yīng)用廣泛的是耦聯(lián)有Alexa Fluor系列染料的抗體（如Alexa Fluor 488, 546, 568, 594, 596, 647, 633）、花青染料（Cyanine）系列標(biāo)記的抗體（如Cy2, Cy3, and Cy5）、FITC及羅丹明（Rhodamine）。其中對(duì)于Alexa Fluor標(biāo)記的二抗，推薦選擇Invitrogen 公司或Molecular Probes公司（現(xiàn)屬于Invitrogen公司），是有名的生產(chǎn)Alexa Fluor染料的公司。從我們收集的數(shù)據(jù)來(lái)看，Jackson Immunoresearch Laboratories公司的花青染料（Cyanine）系列標(biāo)記的二抗使用較多，而對(duì)于FITC，Jackson Immunoresearch Laboratories、Santa Cruz Biotechnology、DAKO 及Sigma公司均可選擇。Bio-Rad、Chemicon、Invitrogen或Sigma公司的羅丹明標(biāo)記的二抗使用較好。另外，如果你想放大檢測(cè)信號(hào)，你可以選擇生物素標(biāo)記的二抗，Jackson Immunoresearch Laboratories、Vector Laboratories 或R&D Systems均是不錯(cuò)的選擇。

對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，F(xiàn)ITC是選用多的標(biāo)簽，PE標(biāo)簽也可以使用。對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)，HRP 和 AP標(biāo)簽使用多。 在**沉淀中，二抗的使用并不是很多，但偶爾也有使用，如用于蛋白的分離，一般選擇無(wú)耦聯(lián)標(biāo)記的二抗。

如果翻看科學(xué)博客例如Research Gate, IHC World, Protocol Online等，你會(huì)發(fā)現(xiàn)很多帖子討論重復(fù)使用抗體，無(wú)論是一抗還是二抗。 這主要是因?yàn)檠芯空呦胪ㄟ^(guò)重復(fù)使用抗體節(jié)省花費(fèi)，盡可能減少研究經(jīng)費(fèi)的預(yù)算。

大多帖子討論western blotting(WB)中的應(yīng)用，也有其它一些談?wù)?*組化中抗體的重復(fù)使用。雖然這些博客中可以搜集到很多有價(jià)值的信息，但我們應(yīng)該記住這些討論只代表某個(gè)研究人員使用特定抗體的經(jīng)驗(yàn)。接下來(lái)我們將討論一些通用話題和建議。

一篇綜述系統(tǒng)總結(jié)了WB中重復(fù)使用一抗和二抗的可能性 [2] 。作者調(diào)查了儲(chǔ)存在4℃（非凍融循環(huán)）或者20℃（涉及每次使用凍融樣品）下5%脫脂牛奶中抗體的效力。但文中沒(méi)有陳述緩沖液（PBS或TBS）的條件。二抗（抗鼠HRP-偶聯(lián)，抗兔HRP偶聯(lián)）都來(lái)源于Sigma-Aldrich。無(wú)論儲(chǔ)存條件如何，二抗至少重復(fù)使用4次探測(cè)0.2μg的靶蛋白，ECL/膜的使用信號(hào)逐漸衰減。但研究并不清楚信號(hào)強(qiáng)度的減弱是否由抗體減少和/或抗體活性下降引起。

有趣的是，這4個(gè)測(cè)試的一抗表現(xiàn)出很大的變異性。一些可以重復(fù)使用至少4次，別的卻只能使用兩次。這關(guān)鍵在于抗體在重復(fù)使用時(shí)是否足夠強(qiáng)。這和多篇科學(xué)博客帖子中的討論相一致。一些研究者善于重復(fù)使用二抗而另一些研究者經(jīng)歷并不愉快，因?yàn)椴⒉皇撬械目贵w表現(xiàn)都一樣。針對(duì)自己的抗體和應(yīng)用建立有效實(shí)驗(yàn)條件非常重要。

儲(chǔ)存緩沖液的選擇也很重要。上述文章中作者只關(guān)注了脫脂牛奶作為儲(chǔ)存試劑的效果。盡管經(jīng)濟(jì)，微生物的生長(zhǎng)會(huì)對(duì)脫脂牛奶的使用帶來(lái)麻煩，除非在其中加入***（盡管疊氮化鈉與HRP-偶聯(lián)抗體合用會(huì)抑制過(guò)氧化物酶活性）。Boonrod等 [2] 報(bào)道“即使加入0.02%的疊氮化鈉，4℃儲(chǔ)存的5%脫脂牛奶使用三次以后顏色變黃并帶有難聞氣味?！逼渌芯空咭灿^察到類似現(xiàn)象，并建議用含有Tween和/或BSA的Tris-緩沖生理鹽水稀釋抗體比較好，尤其是在需要4℃儲(chǔ)存重復(fù)使用抗體的情況下。如果二抗與熒光染料相偶聯(lián)，避光儲(chǔ)存抗體同樣很重要。

Brelje等 [3] 表示他們?cè)诩す鈷呙韫簿劢癸@微鏡時(shí)通常會(huì)回收二抗。他們發(fā)現(xiàn)使用熒光染料耦合的抗體，非特異性背景熒光會(huì)隨著抗體的重復(fù)使用而減少（作者沒(méi)有具體陳述二抗重復(fù)使用多少次）。作者還發(fā)現(xiàn)熒光染料偶聯(lián)的抗體在反復(fù)凍融時(shí)容易聚合。如果這真的適用的話，科研人員在重復(fù)使用熒光標(biāo)記的抗體（無(wú)論何種用途）也許都應(yīng)考慮儲(chǔ)存在4℃。

如何選擇**抗體以及二抗應(yīng)用實(shí)例分析

顯然，無(wú)論是WB還是**組化實(shí)驗(yàn)都可以重復(fù)使用二抗。然而并不是所有抗體在重復(fù)使用中都表現(xiàn)良好，研究者應(yīng)確認(rèn)他們使用的何種特定抗體能多次重復(fù)使用。同時(shí)，考慮重復(fù)使用二抗是否劃算也很重要。因?yàn)橛泻芏嘁蛩囟紩?huì)影響，比如抗體的成本（相對(duì)便宜的HPR-偶聯(lián)抗體還是更貴的熒光染料偶聯(lián)抗體）以及某個(gè)實(shí)驗(yàn)室抗體的消耗。此外，有實(shí)驗(yàn)室因?yàn)闆](méi)能成功重復(fù)使用二抗而導(dǎo)致樣本珍貴的實(shí)驗(yàn)失敗，無(wú)論怎樣的經(jīng)濟(jì)收益都是得不償失的。